多重免疫組化檢測實驗步驟：

1．包埋好的標本用石蠟切片機切片3um

2．經60℃烘片1小時

3．二甲苯Ⅰ脫蠟10分鐘

4．二甲苯Ⅱ脫蠟10分鐘

5．梯度酒精復水：100%酒精5分鐘，100%酒精5分鐘，95%酒精5分鐘，80%酒精5分鐘，自來水沖洗 5分鐘

6．進行抗原修復：將切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸櫞酸液修復液中，沸水浴20分鐘，停止加熱后自然冷卻20-30分鐘

7. 用PBS 3分鐘3次，組畫筆畫圈，滴加雙氧水，孵育20min

8．用PBS 3分鐘3次，滴加封閉血清封閉1h

9．甩干，滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜

10．用PBS 3分鐘×5次洗去一抗

11．甩干，滴加二抗室溫置孵育盒中孵育1小時（注意二抗種屬，夏季30min，冬季1h）

12．用PBS 3分鐘×5次洗去二抗

13．甩干，滴加DAB 顯色，水沖

14．蘇木素染核5min (新配置的蘇木素視情況而定)

15．流水沖洗多余的蘇木素，分化液中分化1秒

16．流水沖洗5min

17．梯度酒精復水：80%酒精5分鐘，95%酒精5分鐘，100%酒精5分鐘，100%酒精5分鐘，二甲苯Ⅱ透明5min，二甲苯Ⅰ透明5min（如為全透明，可適當延長時間）

18．用中性樹膠封片

19．鏡檢